Affacciato sulla piazza più bella della città, questo complesso chiude le due file di portici divergenti di via Santo Stefano. Formato da quattro chiese, risale al 392, quando Ambrogio, vescovo di Milano, pose un piccolo sacello con le reliquie dei santi martiri bolognesi Vitale e Agricola. Mezzo secolo più tardi il vescovo di Bologna, Petronio, fece ricostruire una riproduzione del Santo Sepolcro di Gerusalemme.
Quando nel 727 i Longobardi conquistarono la città, il santuario diventò il loro principale centro religioso. Dopo un periodo di abbandono, verso la fine del X secolo, i benedettini iniziarono la ricostruzione, creando una basilica simile a un gioco di scatole cinesi fatta di chiese e cortili, chiostri e passaggi  in un insieme che ha conservato il suo fascino anche dopo i restauri realizzati dal 1870 al 1930.
Il Museo della basilica, piccolo ma interessante, conserva alcune opere di rilievo, tra cui un trittico medievale di Simone dei Crocifissi con i Santi Benedetto, Sisto e Procolo.