La Galleria degli Uffizi, una delle più famose collezioni d’arte del mondo, fu costruita tra il 1560 e il 1581 da Giorgio Vasari e, dopo la sua morte, da Bernardo Buontalenti. Francesco I fece adibire la galleria all’ultimo piano del palazzo a esposizione dei tesori artistici dei Medici. La collezione fu divisa nell’800, gli oggetti antichi andarono ad arricchire il Museo archeologico mentre le sculture vennero trasferite al Bargello, lasciando agli Uffizi una splendida raccolta di dipinti.

Tra i dipinti più belli presenti nella galleria vanno ricordati:
Bacco. Opera del primo Caravaggio, raffigura il dio del vino come un giovane pallido e dissoluto; l’atmosfera di dissolutezza è espressa anche attraverso la natura morta.
Annunciazione e due santi. Capolavoro del senese Simone Martini, in origine destinato al Duomo di Siena. Al cognato di Martini, Lippo Memmi, si attribuiscono i due santi laterali (Ansano e Giuditta).
Madonna d’Ognissanti. Pala d’altare di Giotto, è considerata una pietra miliare nello studio della prospettiva per il suo effetto di profondità.
Duca e Duchessa di Urbino. I due dipinti di Piero della Francesca ritraggono di profilo Federico da Montefeltro e sua moglie Battista Sforza. Colpiscono per la cura dei particolari fisionomici e del paesaggio.
Nascita di Venere. La seducente immagine di Botticelli mostra la dea romana dell’amore, nata durante una tempesta nel mare Egeo, sospinta a terra da Zefiro, dio del vento, e salutata dalle ninfe, pronte ad avvolgerla in un mantello.
Sacra Famiglia o Tondi Doni. Questo dipinto di Michelangelo rappresenta la Sacra Famiglia in modo assolutamente non convenzionale, per la postura e i colori.
Venere di Urbino. Sensuale nudo di Tiziano, ispirato alla Venere dormiente di Giorgione, fu condannato perché la dea, forse in realtà una cortigiana, è ritratta in una posa lasciva.